超滤离心管操作指南:3大误区毁样本|附分子截留/离心参数对照表
超滤回收率<50%?本文详解Millipore/Amicon超滤管选型技巧、离心程序、防堵膜策略,提供蛋白浓缩/缓冲液置换/脱盐全方案!附转速-分子量计算公式+堵膜急救方案。
一、超滤管选型黄金法则(立即避坑)
需求 | 膜材质 | 截留分子量 | 代表产品 |
蛋白浓缩 | 再生纤维素 | 10kDa | Amicon® Ultra-4 |
病毒纯化 | PES | 100kDa | Millipore UFC9100 |
核酸回收 | 低吸附PVDF | 30kDa | Vivaspin® 20 |
内毒素去除 | 超低吸附 | 3kDa | Amicon® Ultra-15 |
>??选错致命伤:截留分子量>目标物→样本穿透丢失!
二、操作流程(4步提升回收率至>90%)
Step1预处理(防膜失效关键!)
1.离心管冰上预冷
2.注入1ml预冷PBS
3.1500g×5min(活化膜孔,去除甘油/乙醇)
Step2样本加载
参数 | 标准值 | 避坑要点 |
最大装载量 | <80%管容积 | 防溢出污染 |
样本粘度 | <50cP(过高需稀释) | 粘度检测方法:移液器吸打阻力 |
保留液体积 | ≥50μl(防干膜) | 定时观察液面 |
Step3离心程序(转速/时间公式)
?离心力计算公式:
RCF(g)=0.00001118×r×(RPM)2
(r=离心半径cm)
分子量-离心参数表:
截留分子量 | 推荐离心力 | 时长 |
3kDa | 4000g | 20-30min |
10kDa | 3500g | 15-25min |
50kDa | 3000g | 10-15min |
>??防过热技巧:4℃离心+每10min暂停降温
Step4样本回收
-正置法:直接吸取浓缩液(回收率80-90%)
-倒置法(高价值样本):
三、3大高频问题急救方案
问题1:膜堵塞(流速骤降)
-处理步骤:
1.用0.1MNaOH反向冲洗10min
2.超纯水冲洗3次
3.500g×5min低速离心疏通
问题2:回收率低
-根因排查:
现象 | 原因 | 对策 |
滤液浑浊 | 膜破裂 | 更换新管(勿超速) |
管壁挂液明显 | 疏水吸附 | 预处理加 0.01% Tween-20 |
问题3:浓缩倍数不足
-科学浓缩比计算:
```
浓缩倍数=初始体积/终体积
(推荐≤10倍,防蛋白沉淀)
```
-高倍浓缩技巧:分次添加样本(维持液面高度)
四、不同应用场景参数优化
实验目标 | 关键参数调整 | 回收率 |
蛋白浓缩 | 4℃ + 3500g × 15min | 92% |
缓冲液置换 | 预装新缓冲液 ×3次 | >99% |
脱盐 | 超纯水稀释 ×5次 | >98% |
外泌体纯化 | 100kDa + 3000g ×30min | 80% |
五、产品推荐
密理博millipore超滤离心管——天津益元利康生物科技有限公司,欢迎咨询。